Lauréats des bourses 2016, 2017 et 2018

Bilan des travaux du docteur Juliette Buffault Duquesne

Introduction : Le trabéculum constitue la principale voie de drainage de l’humeur aqueuse hors de l’oeil et son dysfonctionnement est à l’origine de l’élévation de la pression intraoculaire (PIO) en cause dans le glaucome.

Objectif : Développer un modèle de trabéculum in vitro à partir de cultures primaires de cellules trabéculaires humaines (HTMC) afin d’étudier les effets du TGF-β2, cytokine profibrotique, sur l’organisation de la matrice trabéculaire. Nous évaluerons sur ce modèle les effets du latanoprost, un analogue de PGF2-α, d’un inhibiteurs des Rho-kinases (ROCK) ainsi que du chlorure de benzalkonium, conservateur utilisé dans les collyres. Nous développerons ce modèle en trois dimensions (3D) afin de mieux comprendre le rôle de l’architecture de cette matrice.

Méthodes : Les HTMC primaires remodelées sous l’effet du TGF-β2 ont été traitées avec du latanoprost avec et sans conservateur ou avec un inhibiteur des ROCK (Y-27632). L’organisation et l’expression de l'actine des muscles lisses (alpha-SMA) et les dépôts de fibronectine ainsi que la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine (MLC-P) et de la Cofiline (Cofiline-P) ont été évaluées par immunofluorescence en microscopie et à l’ArrayScanTM.

Résultats : Le TGF-β2 a induit une augmentation de l’expression d’alpha-SMA et de fibronectine dans les HTMC. Le latanoprost n’a pas modifié l’expression de l'alpha-SMA, mais a fortement diminué les dépôts de fibronectine. L’inhibiteur de ROCK Y-27632 diminue les expressions d’alpha-SMA et de fibronectine induites par le TGF-β2 ainsi que la MLC-P et la Cofiline-P. La culture en 3D dans le Matrigel nous a permis d’obtenir une organisation des cellules trabéculaires en mailles, très proche de la physiologie. Les effets sur l’architecture du cytosquelette ont été validés en 3D.

Conclusion : Nous avons réussi à développer un nouveau modèle de trabéculum en 3D in vitro à partir de HTMC primaires reproduisant une organisation du trabeculum plus proche de la réalité anatomique. Celui-ci a été validé en reproduisant les effets connus du TGF-β2. Il permettra d’identifier plus précisément les effets sur l’architecture du trabéculum de différentes molécules toxiques ou pro-inflammatoires mais aussi l’efficacité de possibles nouvelles approches thérapeutiques modulant le cytosquelette.

* * * 

Projet de recherche du docteur Juliette Buffault Duquesne, lauréate 2018

Le glaucome est une neuropathie optique cécitante qui touche plus de 60 millions de personnes à travers le monde. Son principal facteur de risque est l'augmentation de la pression intraoculaire (PIO). Le trabeculum constitue la principale voie de drainage de l'humeur aqueuse hors de l'oeil et son dysfonctionnement est à l'origine de l'élévation de la PIO. Les mécanismes à l'origine de ce dysfonctionnement trabéculaire restent encore aujourd'hui mal compris.

Rationnel : A l'heure actuelle, pour étudier le trabeculum nous ne disposons que de modèles animaux et de cultures cellulaires in vitro en deux dimensions (2D). La structure du trabeculum des animaux n'est cependant pas identique à celle du trabéculum humain et la régulation de l'excrétion d'humeur aqueuse est, elle aussi, différente. Les résultats obtenus avec des modèles animaux ne sont donc pas toujours transposables à l'homme. Ils sont en outre critiqués d'un point de vue éthique. Les modèles de culture cellulaire en 2D représentent une alternative intéressante aux modèles animaux pour l'analyse du trabéculum. Mais l'absence de différenciation, polarisation, ou encore de reapports avec une MEC les rend insuffisants. Ils ne reflètent malheureusement pas l'architecture réelle du trabéculum. Il semblerait cependant que cette architecture déficiente soit justement à l'origine de son dysfonctionnement. C'est pourquoi un modèle cellulaire de trabéculum en trois dimensions (3D) serait un outil idéal pour faire avancer la recherche sur cette pathologie en prenant en compte la biomécanique qui est un élément clé dans la physiopathogénie du glaucome. Cela permettrait aussi de mieux comprendre le fonctionnement physiologique du trabéculum mais aussi son comportement dans des conditions de stress ou de toxicité, et aussi l'effet des traitements.

Objectif : L'objectif de ce projet de recherche consiste donc à développer un modèle de trabéculum in vitro en 3D à partir de cultures primaires de cellules humaines trabéculaires. Nous comparerons notre modèle issu de cellules primaires au modèle qui avait été développé à partir de cellules de lignées trabéculaires en étudiant l'effet du TGF-B2 sur l'organisation de la matrice trabéculaire. Une fois ce modèle de dégénérescence trabéculaire en 3D mis au point, nous testerons sur celui-ci l'effet du latanoprost et des inhibiteurs des Rhokinases sur le cytosquelette des cellules du trabéculum. Nous pourrons ainsi identifier précisemment les effets sur le cytosquelette et la MEC de différentes molécules toxiques ou pro-inflammatoires comme les conservateurs ou le TGF-B2 mais aussi l'efficacité de possibles nouvelles approches thérapeutiques modulant le squelette.

Résultats escomptés : Le développement d'un modèle in vivo de trabéculum en 3D permettra d'étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques et de réaliser des tests précliniques sur de nouvelles molécules anti-glaucomateuses. Le modèle de trabéculum obtenu par culture cellulaire 3D mis au point pourra être utilisé afin de préciser les facteurs de résistance à l'écoulement de l'humeur aqueuse hors de l'oeil. Ce système pourrait également réduire le recours à l'expérimentation animale.

De gauche à droite, Marie Larroumet, administratrice de la Fondation, le docteur Juliette Buffault Duquesne, lauréate 2018, et Pierre Tricot, président

*  *  *

Projet de recherches du docteur Damien Guindolet, lauréat 2017

Dans sa séance du 17 mai 2017, le conseil d'administration de la Fondation, sur proposition du comité scientifique, a attribué la bourse 2017/2018 au docteur Damien GUINDOLET pour ses travaux portant sur la recherche de nouveaux traitements générant la survie et la multiplication des cellules souches chez des patients souffrant d'une brûlure oculaire sévère.

Résumé 

La cornée est la partie transparente située à l'avant de l'oeil. Les cellules les plus superficielles de la cornée constituent l'épithélium cornéen, sorte d'équivalent de l'épiderme de la peau. Ces cellules sont en renouvellement perpétuel grâce à la présence de cellules souches. Il faut un nombre suffisant de cellules souches pour maintenir un épithélium en bonne santé. Si ce nombre est trop bas ou que les cellules souches disparaissent complètement, le patient souffre de problèmes de cicatrisation, de douleurs ; la cornée s'opacifie, ce qui entraîne une baisse de vision profonde. Sans un épithélium cornéen en bonne santé, même une greffe de cornée, ne peut pas fonctionner et sera vouée à l'échec. On observe une destruction des cellules souches lors des brûlures de l'oeil par un produit chimique, lors d'un accident domestique (lessive par exemple) ou de travail ou lors d'agressions (gaz lacrymogène, etc...) ; cela survient plus souvent chez des personnes jeunes, et les conséquences sont dramatiques si les 2 yeux sont atteints.

Nous souhaitions identifier et développer de nouveaux traitements pour favoriser la survie et la multiplication des cellules souches chez des patients souffrant d'une brûlure oculaire sévère. Nous avons identifié une molécule, EMMPRIN, présente à la surface des cellules qui entraîne une fonte de la cornée quand l'épithélium ne cicatrise pas : mais étonnamment, cette molécule est aussi présente à l'état normal et il a même été démontré que cette molécule intervient dans le maintien du caractère souche des cellules. Comment expliquer ce phénomène ? "La glycosylation". La molécule EMMPRIN, avant d'arriver à la surface de la cellule, subit différentes transformations, notamment l'ajout de sucres à des endroits bien précis ; ces modifications modifient profondément la manière dont la molécule va pouvoir interagir avec d'autres molécules pour produire ses effets. Nous souhaitons évaluer les effets sur les cellules souches de modification de l'organisation des sucres sur EMMPRIN, c'est à dire si elles survivent et se multiplient mieux. Grâce à ces découvertes, nous serions en mesure d'améliorer la survie des cellules souches à la fois au laboratoire mais également chez nos patients souffrants de brûlures chimiques ou même d'autres maladies où elles sont en péril.

De gauche à droite : Le docteur Damien Guindolet, lauréat 2017, et Pierre Tricot

*  *  *

Bilan des travaux du docteur Antoine Rousseau, lauréat 2016 

 

Unilatéralité des kératites herpétiques :

Une voie pour le développement d’une réelle stratégie préventive ?

Le virus Herpes Simplex de type 1 (HSV1) est responsable chez l’homme d’infections oculaires récidivantes unilatérales, en particulier de la cornée (kératites herpétiques). A force de récidives, les kératites herpétiques entraînent une opacification de la cornée, et représentent la première cause de cécité unilatérale d'origine infectieuse dans les pays occidentaux. Les traitements actuels, reposant sur les antiviraux, permettent de diminuer la fréquence et les conséquences des récidives, mais ne sont pas totalement efficaces. De plus, l'utilisation massive de ces traitements est responsable de l'émergence de résistances aux antiviraux. Enfin les différentes tentatives de stratégies vaccinales, reposant jusque-là sur des vaccins sous-unitaires, n'ont jamais donné de résultats.

Pour la presque totalité des patients concernés, les kératites herpétiques restent unilatérales au cours des récidives successives, alors que les études réalisées sur tissus prélevées lors d'autopsie ont montré que le virus est en réalité présent à l’état latent dans les deux ganglions trigéminés (des structures nerveuses sensitives proches du cerveau) qui sont les sites principaux hébergeant les virus latents et siège des réactivations de ce virus.

Il semble donc exister un phénomène particulier qui contraint un des deux ganglions trigéminés (TG) humains à être infecté de façon latente mais sans capacité de réactivation herpétique. Ceci a pu être reproduit dans un modèle animal, chez la souris, et les résultats obtenus suggèrent qu’une prévention efficace de l’herpès oculaire pourrait être obtenue à terme grâce à l'utilisation de virus inactivés.

Le modèle animal murin utilisé repose sur une inoculation de HSV1 par voie orale (pour reproduire la voie naturelle de primo-infection chez l’homme), qui entraine une infection latente dans les deux TG mais une infection oculaire uniquement du côté de l’inoculation. La séquence d’inoculation a été modifiée dans la présente étude, en inoculant les animaux d’un côté avec une souche de HSV1 et de l’autre côté avec une autre souche virale, puis nous avons analysé les capacités neuro-invasives et de réactivation des deux souches de HSV1 (génétiquement modifiées afin de pouvoir les distinguer).

L’inoculation d’une souche peu virulente de HSV1 d’un côté des muqueuses orales permet de prévenir l’infection induite par une seconde souche, pleinement virulente, inoculée de l’autre côté. Elle ne permet pas en revanche de bloquer les capacités de réactivation virale.

En revanche, l’inoculation d’une souche non neuro-virulente (atténuée) de HSV1 préalablement à celle d’une autre souche virale, sauvage et donc pleinement virulente, inhibe toute pathogénie aiguë de cette dernière, et bloque ses capacités de réactivation.

Ces résultats suggèrent que la primo-infection herpétique par voie orale (comme chez l’homme) entraîne très rapidement un état réfractaire de l’ensemble des neurones du système trigéminé vis à vis d’une surinfection herpétique, ce qui explique qu’un des deux TG soit, en conditions naturelles, impropre à générer des réactivations herpétiques cliniques.

Ces données permettent de mieux comprendre l’apparent paradoxe entre latence herpétique dans les deux TG et réactivations unilatérales. Elles ouvrent en outre la voie au développement d’une stratégie réellement préventive de l’infection herpétique récidivante.

 

De gauche à droite : Le docteur Antoine Rousseau, lauréat 2016, et Pierre Tricot